光学显微镜

optical microscope

利用光学原理把人眼所不能分辨的微小物体放大成像,以供人们提取微细结构信息的光学仪器。

简史 早在公元前 1世纪,人们就已发现通过球形透明物体去观察微小物体时可以使其放大成像。后来逐渐对球形玻璃表面能使物体放大成像的规律有了认识。1590年,荷兰和意大利的眼镜制造者已经造出类似显微镜的放大仪器。1610年前后,意大利的伽利略和德国的J.开普勒在研究望远镜的同时,改变物镜和目镜之间的距离,得出合理的显微镜光路结构,当时的光学工匠遂纷纷从事显微镜的制造、推广和改进。17世纪中叶,英国的R.胡克和荷兰的 A.van列文胡克都对显微镜的发展作出了卓越的贡献。1665年前后,胡克在显微镜中加入粗动和微动调焦机构、照明系统和承载标本片的工作台。这些部件经过不断改进,成为现代显微镜的基本组成部分。1673~1677年期间,列文胡克制成单组元放大镜式的高倍显微镜,其中9台保存至今。胡克和列文胡克利用自制的显微镜在动、植物机体微观结构的研究方面取得了杰出的成就。19世纪,高质量消色差浸液物镜的出现使显微镜观察微细结构的能力大为提高。1827年G.B.阿米奇第一个采用浸液物镜。19世纪70年代,德国人E.阿贝奠定了显微镜成像的古典理论基础。这些都促进了显微镜制造和显微观察技术的迅速发展,并为19世纪后半叶包括R.科赫、L.巴斯德等在内的生物学家和医学家发现细菌和微生物提供了有力的工具。

在显微镜本身结构发展的同时,显微观察技术也在不断创新:1850年出现了偏光显微术,1893年出现了干涉显微术,1935年荷兰物理学家F。泽尔尼克创造了相衬显微术,他为此在1953年被授予诺贝尔物理学奖金。

古典的光学显微镜只是光学元件和精密机械元件的组合,它以人眼作为接收器来观察放大的像。后来在显微镜中加入了摄影装置,以感光胶片作为可以记录和存储的接收器。现代又普遍采用光电元件、电视摄象管和电荷耦合器等作为显微镜的接收器,配以微型电子计算机后构成完整的图象信息采集和处理系统。

工作原理 表面为曲面的玻璃或其他透明材料制成的光学透镜可以使物体放大成像。光学显微镜就是利用这一原理把微小物体放大到人眼足以观察的尺寸。近代的光学显微镜通常采用两级放大,分别由物镜和目镜完成。被观察物体AB位于物镜的前方,被物镜作第一级放大后成一倒立的实象A1B1。然后此实像再被目镜作第二级放大,成一虚象A2B2,人眼看到的就是虚像A2B2。

显微镜的总放大倍率为
显微镜总放大倍率=物镜放大倍率×目镜放大倍率

放大倍率是指直线尺寸的放大比而不是面积比。在用人眼直接观察的显微镜中,可以在实像面A1B1处放置一块薄型平板玻璃片,其上刻有某种图案的线条,例如十字线。当实像A1B1和这些刻线叠合在一起时,利用这些刻线就能对物体进行瞄准定位或尺寸测量。这种放置在实像面处的薄型平板玻璃片通称分划板。在新型的以光电元件作为接收器的光学显微镜中,电视摄象管的靶面或其他光电元件的接收面就设置在实像面上。

组成 光学显微镜由载物台、聚光照明系统、物镜、目镜和调焦机构组成。

载物台 用于承放被观察的物体。利用调焦旋钮可以驱动调焦机构使载物台作粗调和微调的升降运动,使被观察物体调焦清晰成象。它的上层可以在水平面内沿、方向作精密移动和在水平面内转动,把被观察的部位调放到视场中心。

聚光照明系统 由灯源和聚光镜构成。当被观察物体本身不发光时,由外界光源给以照明。照明灯的光谱特性必须与显微镜的接收器的工作波段相适应。聚光镜的功能是使更多的光能集中到被观察的部位。

物镜 位于被观察物体附近实现第一级放大的镜头。在物镜转换器上同时装着几个不同放大倍率的物镜。转动转换器可让不同倍率的物镜进入工作光路。物镜放大倍率通常为5~100倍。物方视场直径(即通过显微镜能看到的图像范围)约为 11-20毫米。物镜放大倍率越高则视场越小。 物镜是显微镜中对成象质量优劣起决定性作用的光学元件。常用的有:①能对两种颜色的光线校正色差的消色差物镜;②质量更高的能对三种色光校正色差的复消色差物镜;③能保证物镜的整个像面为平面以提高视场边缘成像质量的平像场物镜。为了提高显微观察的分辨率,在高倍物镜中采用浸液物镜,即在物镜的下表面和标本片的上表面之间填充折射率为1.5左右的液体。

目镜 位于人眼附近实现第二级放大的镜头。目镜放大倍率通常为5~20倍,按能否放置分划板,可分成两类:①不宜放置分划板的,如惠更斯型目镜。这是现代显微镜中常用的型式,优点是结构简单、价格低廉;缺点是由于成像质量的原因,不宜放置供瞄准定位或尺寸测量用的分划板。②能放置分划板的,如凯尔纳型和对称型目镜,它们能克服上述目镜的缺点。按照能看到的视场大小,目镜又分为视场较小的普通目镜和视场较大的大视场目镜(或称广角目镜)两类。

调焦机构 载物台和物镜两者必须能沿物镜光轴方向作相对运动以实现调焦,获得清晰的图像。用高倍物镜工作时,容许的调焦范围往往小于微米,所以显微镜必须具备极为精密的微动调焦机构。

显微镜放大倍率的极限 显微镜放大倍率的极限即有效放大倍率。仪器的分辨率是指仪器提供被测对像微细结构信息的能力。分辨率越高则提供的信息越细致。显微镜的分辨率是指能被显微镜清晰区分的两个物点的最小间距。根据衍射理论,显微物镜的分辨率为
sigma=0.61lamda/N.sinU ~1式中lamda为所用光波的波长;N 为物体所在空间的折射率,物体在空气中时N=1;U为孔径角,即从物点发出能进入物镜成像的光线锥的锥顶角的半角;NsinU 称为数值孔径。 当波长λ一定时, 分辨率取决于数值孔径的大小。数值孔径越大则能分辨的结构越细,即分辨率越高。数值孔径是显微物镜的一个重要性能指标,通常与放大倍率一起标注在物镜镜筒外壳上,例如40×0.65表示物镜的放大倍率为40倍,数值孔径为0.65。
分辨率和放大倍率是两个不同的但又互有联系的概念。当选用的物镜数值孔径不够大,即分辨率不够高时,显微镜不能分清物体的微细结构,此时即使过度地增大放大倍率,得到的也只能是一个轮廓虽大但细节不清的图像。这种过度的放大倍率称为无效放大倍率。反之如果分辨率已满足要求而放大倍率不足,则显微镜虽已具备分辨的潜在能力,但因图像太小而仍然不能被人眼清晰视见。为了充分发挥显微镜的分辨能力,应使数值孔径与显微镜总放大倍率合理匹配,以满足下列条件:
500NsinU<显微镜总放大倍率<1000NsinU ~2
在此范围内的放大倍率称为有效放大倍率。由于sinU永远小于1,物方空间折射率N最高约为1.5,NsinU不可能大于1.5,故光学显微镜的分辨率受(1)式限制,具有一定的极限。有效放大倍率受上式限制,一般不超过1500倍。显微镜使用者应由所需分辨的最小尺寸按(1)式确定所需的数值孔径,选定物镜,然后按(2)式选定总放大倍率和目镜放大倍率。
提高分辨率的途径是:采用较短波长的光波或增大孔径角U值,或是提高物体所在空间的折射率N,例如在物体所在空间填充折射率为 1.5的液体。以这种方式工作的物镜称为浸液物镜。而电子显微镜正是利用波长极短的特性,在提高分辨率方面取得重大突破的。

聚光照明系统对显微观察的影响 聚光照明系统是对显微镜成像性能有较大影响但又易于被使用者忽视的环节。它的功能是提供亮度足够且均匀的物面照明。聚光镜发来的光束应能保证充满物镜孔径角,否则就不能充分利用物镜所能达到的最高分辨率。为此目的,在聚光镜中设有类似照相物镜中的可以调节开孔大小的可变孔径光阑,用来调节照明光束孔径,以与物镜孔径角匹配。观察高反差物体时,宜使照明光束充满物镜的全孔径;对于低反差物体,宜使照明光束充满物镜的2/3孔径。在较完善的柯勒照明系统中,除可变孔径光阑外,还装有控制被照明视场大小的可变视场光阑,以保证被照明的物面范围与物镜所需的视场匹配。物面被照明的范围太小固然不行,过大则不仅多余,甚至有害,因为有效视场以外的多余的光线会在光学零件表面和镜筒内壁多次反射,最后作为杂散光到达像面,使图像的反差下降。

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